Severidad del SII: Se utilizará la IBS- Severty Scoring System (IBS- SSS) (Anexo 4) 6.
Escala de Likert: Anexo 2
Escala de Bristol: Anexo 3
 Laboratorio: Se solicitarán las siguientes determinaciones a todos los pacientes incluídos, ademas de los analisis generales: albúmina, magnesemia, dosaje de vitamina D, ácido fólico, vitamina B12, colesterol, tiempo de protrombina.

Mediciones Psicológicas: Se utilizará la escala Hopital Anxiety and Depression para identificar y excluir pacientes con depresión o ansiedad severas (score >18) (Anexo 5) 7. Se utilizará el PHQ-15 para evaluar somatización (Anexo 6) 8.


 Evaluación de Sobrecrecimiento Bacteriano Intestinal 
 La  medición se llevará a cabo mediante un cromatógrafo de gases (Equipo Quintron).
El día previo al estudio el paciente debe de comer solo alimentos hervidos, carnes a la parrilla, agua sin gas, suspender el cigarrillo. El día del estudio debe concurrir con 12 horas de ayuno y se le realizará previo al test del aire espirado una exhaustiva  higiene oral con Clorhexidina. 
1.	Se tomarán  muestras de aire en una jeringa al término de una espiración,  cada 15 minutos durante 180 minutos, antes y después de ingerir 50g de glucosa en 200cc de agua.  Las muestras serán analizadas con el Cromatógrafo de gases, los resulta-dos serán expresados en partes por millón (ppm).
2.	Se considerará positivo, es decir presencia de sobrecrecimiento bacteriano intesti-nal, un valor basal de hidrógeno sobre 20 ppm o 2 lecturas sobre 20 ppm durante los primeros 60 minutos. La cuantificación del SBI se realizará sumando las lecturas del H2 espirado durante los primeros 60 minutos (H260).
3.	Se considerará positiva la prueba de metano en aire espirado: ≥ 3 ppm en cualquier medición durante los 180 minutos.
Determinación de los niveles de citoquinas
Se utilizará el kit Bio-Plex Pro human cytokine, chemokine, and growth factor assayswash steps de 27 paneles, con lo que determinarán las concentraciones de: IL-1B, IIL- 1ra, L-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 12, IL-13, IL-15, IL-17, basic FGF,  Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN gamma, IP-10, MCP-1, MIP 1 alfa, MIP 1 beta, PDGF- BB, RANTES, TNF alfa, VEGF.

Estudio de la microbiota intestinal por secuenciación
Estudio de la microbiota intestinal por secuenciación masiva (NGS)
En los últimos años la microbiota del tracto gastrointestinal ha sido estudiada utilizando secuenciación masiva (Next Generation Sequencing, NGS) con dos enfoques diferentes: 1) Estudios de tipo ecológico y/o caracterización taxonómica basado en secuenciación por amplicones (Amplicon sequencing) del gen 16S y/o 18S del ARNr, 2) Secuenciación de genoma completo (Whole Genome Shotgun, WGS).
El análisis de ADN metagenómico extraído de muestras biológicas permite obtener infor-mación de la composición genética y filogenética de la comunidad de microorganismos que en ellas habitan. Estos análisis se pueden realizar mediante la amplificación de mar-cadores conservados que permitan definir la filogenia y taxonomía de los microorganis-mos presentes en la muestra estudiada. Para reconstruir relaciones filogenéticas es necesario que la secuencia de ADN amplificada refleje la distancia evolutiva entre los microorganismos. Para Bacteria y Arquea suele utilizarse como marcador el gen de la subunidad ribosomal 16S. La elección de este marcador se basa en que es buen cronómetro evolutivo debido a que algunas regiones de la secuencia se encuentran muy bien conservadas (ideales para diseñar oligos).
Las tecnologías de secuenciación masiva se convirtieron en un método simple y rápido para el análisis de comunidades microbianas y junto con herramientas bioinformáticas avanzadas han permitido rápidos avances en la ecología microbiana y la microbiología ambiental. Esto se debe a que permiten el análisis de miles de secuencias del gen 16S de ARNr obteniendo así una cuantificación correcta de la diversidad microbiana.
Herramientas de análisis en ecología de comunidades
La biodiversidad de un ambiente o hábitat puede estudiarse en el marco de la ecología de comunidades. Por definición, una comunidad es un grupo de especies que interaccionan en un lugar determinado en un tiempo determinado. La diversidad de una comunidad de microorganismos dentro de un determinado hábitat puede ser definida entonces según la riqueza de especies y su abundancia en un momento determinado.
La diversidad α se refiere a la diversidad de un hábitat o sitio. La diversidad β se refiere a la diversidad entre hábitats o sitios. La diversidad puede medirse en base a la presencia-ausencia de especies y/o según la abundancia de organismos de cada especie. Para el análisis de comunidades microbianas se hablará de unidades taxonómicas operacionales (OTUs por sus siglas en inglés). Una forma de visualizar los resultados de diversidad α, suelen ser las curvas de rarefacción. Las mismas se construyen a partir de determinar el valor que adopta una métrica de diversidad determinada, como ser la cantidad de OTUs observados, para cada esfuerzo de muestreo o cantidad de secuencias.
La diversidad β explica la diversidad entre comunidades. Existe un gran número de dis-tancias de diversidad que pueden medirse entre comunidades. Las métricas más utiliza-das en ecología microbiana son Bray Curtis, weighted Unifrac y unweighted Unifrac. Bray Curtis tiene en cuenta la presencia y abundancia de especies. Unifrac tiene en cuenta además la relación filogenética entre OTUs y mide la cantidad de historia evolutiva que es única para cada par comparado. Una vez construidas las matrices de distancias, los datos pueden ser visualizados mediante diferentes métodos. Uno de los más utilizados es el análisis de coordenadas principales (PCoA). El objetivo de un análisis de ordenamiento es representar datos multivariados, como ser la abundancia de OTUs y la distancia ecológica entre comunidades, en un número reducido de ejes ortogonales .
Materiales y métodos
I. Procesamiento de las muestras y secuenciación
Se tomarán muestras de materia fecal de los pacientes en estudio, se almacenarán en recipientes especiales para su preservación y se realizará la extracción de ADN total. Se tomarán muestras antes de la primera administración de prebióticos (medición basal) y luego de 30 días del inicio de la intervención, en el mismo intervalo en que se analizan otros parámetros como cambios en la sintomatología y en las pruebas clínicas llevadas a cabo.
Protocolo conservación y transporte heces
 	Utilizar frasco seco para recolectar heces, para análisis químico-físicas, estéril (sin ningún solvente añadido)
 	Abrir el contenedor al momento de recolectar la muestra
 	Recolectar una deposición espontánea en cualquier momento del día en colector estéril.
 	Recoger la muestra en el contenedor teniendo cuidado que no se contamine con orina.
 	Si la muestra no puede ser recolectada directamente en colector estéril puede utilizarse una bandeja de plástico para recolectar la muestra y luego pasar una porción de la misma al colector estéril con la ayuda de una espátula de madera.

 	Asegurarse de cerrar bien el frasco.
 	Una vez recogida la muestra, el colector debidamente tapado deberá colocarse dentro de una bolsa de seguridad tipo Ziploc.

 	La muestra tiene que ser entregada al laboratorio dentro de 8 horas. 
 	
 	Mantener la muestra refrigerada en heladera hasta el momento de la entrega al laboratorio. El envío deberá realizarse colocando la bolsa con el colector dentro de una caja de telgopor con refrigerantes.
 	Si la muestra va a enviarse luego de las 24hs de recolectada, la misma deberá congelarse a -20° o -70°, según las posibilidades, hasta el envío. En este caso, el mis-mo deberá realizarse con hielo seco para asegurar que la muestra permanezca conge-lada.

Se realizará la secuenciación por NGS de amplicones de la subunidad bacteriana 16S, con un estimativo de 100 mil lecturas.
Se analizará a continuación la diversidad microbiana identificada y los componentes de la misma. Se medirán diferencias en estos parámetros entre los distintos momentos evaluados, y se contrastarán con los diversos factores clínicos y biológicos analizados.
II. Procesamiento y análisis de las secuencias obtenidas. Materiales a utilizar
Para el análisis de los datos serán necesarios los siguientes recursos: 
Computadora personal de 8 GB de RAM y processore Intel(R) Celeron(R) CPU J1900 1.99 GHz2. 
Procesamiento en Google Cloud Platform
3. Conexión a Internet
4. Sistema operativo Microsoft Windows 10 Pro, 64 bit (x64)
5. Softwares: QIIME v1, R v3.6.1, RStudio v1.1.4566. 
6. Paquetes de R: vegan,  phyloseq, ggplot2, tidyverse, tidyr, dplyr, DESeq2, multtest 

Análisis de los datos
Para el análisis de las secuencias obtenidas por NGS se utilizará el paquete informático QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology). QIIME es un paquete bioinformático de código abierto que implementa métricas de diversidad, métodos estadísticos y herra-mientas de visualización para el análisis de datos microbianos.

 En primer lugar, se llevará a cabo el demultiplexado (separación de las secuencias por paciente) y se aplicará un filtro de calidad de las secuencias. Luego, se agruparán las secuencias en unidades taxonómicas operacionales (OTUs) al 97% de similitud y se seleccionarán las secuencias representantes de cada OTU tomando como representativa la secuencia más abundante en cada uno de ellos.
Se alinearán las secuencias representantes utilizando como alineamiento de referencia el dataset de Greengenes dedicado a bacterias y arqueas. Las asignaciones taxonómicas para cada secuencia representante de cada OTU serán realizadas utilizando la base de datos Greengenes. Las tablas de OTUs informan cuántas secuencias por muestra perte-necen a cada cluster/OTU y las tablas de taxonomía informan cuántos OTUs caen dentro de la misma clasificación taxonómica.
Para el cálculo de las métricas de diversidad α se realizarán rarefacciones en base a las tablas de OTUs. Luego, sobre cada tabla generada se calcularán los OTUs observados. Los resultados serán integrados para la construcción de curvas de rarefacción en un único archivo final por métrica.
Las métricas de diversidad β serán calculadas utilizando las métricas de weighted y un-weighted Unifrac
Para determinar la presencia significativa de estructuras o agrupamientos en los datos de diversidad β se utilizará el test no paramétrico ANOSIM. El estadístico en la prueba ANO-SIM puede interpretarse como un coeficiente que indica el grado del agrupamiento. Valo-res cercanos a uno indicarán un agrupamiento fuerte, mientras que al acercarse a cero indicarán menor correlación de los datos con los grupos evaluados.
Estudio de la barrera intestinal
Se determinará el nivel de anticuerpo anti- zonulina en sangre periférica mediante un kit comercial Elisa (Zonulin ELISA Kit . IMMUNDIAGNOSTIK AG) 
Estudio del metaboloma
La metabolómica es un núcleo de la investigación en biología de sistemas, centrada en el estudio holístico de los metabolitos orgánicos de bajo peso molecular (típicamente <1500 Da).  Los metabolitos tienen un papel importante en los sistemas biológicos.  Son los componentes básicos de muchos otros componentes biológicos (por ejemplo, proteínas, ARN, ADN y paredes celulares), son fundamentales en el metabolismo intermediario, proporcionan muchas necesidades para la vida y desempeñan un papel activo en la regulación y la señalización.  En mamíferos, la metabolómica se aplica al estudio de enfermedades humanas, define los procesos patológicos y descubre biomarcadores. También se utiliza en el estudio de toxicidad y eficacia de los medicamentos, en el estudio de la interacción del entorno y el genotipo y en el estudio de los lípidos (lipidomics).  Las metodologías de metabolómica se dividen en dos grupos distintos: metabolómica no dirigida y metabolómica dirigida. La primera se refiere a un análisis exhaustivo previsto de todos los analitos medibles en una muestra, incluidas las sustancias químicas desconocidas.  Este enfoque parte de una posición de conocimiento biológico limitado con el objetivo de adquirir e interrogar datos relacionados con una amplia y diversa gama de metabolitos en el metaboloma. 
En cambio, la metabolómica dirigida implica la medición de grupos definidos de metaboli-tos caracterizados químicamente y anotados bioquímicamente [40].  Los estudios de perfil metabólico utilizan plataformas analíticas que incluyen cromatografía de gases (GC) o líquida (LC) acoplada a MS, electroforesis capilar-MS.  Espectroscopía de RM, espec-troscopia infrarroja y Raman, detectores electroquímicos e infusión directa (o inyección) MS.

Metabólica
Metabolómica no dirigida
Preparación de las muestras: Recoger 2 ml de plasma en tubos Eppendorf, en duplicado. Las muestras tienen que ser liofilizadas antes de ser enviadas.
Método: Las muestras serán analizadas siguiendo el protocolo de Dunn et al. [1], con al-gunas modificaciones, a través de UPLC-MS. Los estudios metabólicos se realizarán en el laboratorio de la Facultad de Farmacia, Universidad de Granada (Granada, ES).
Una alícuota de 400 μl de las muestras reconstituidas de plasma se añade a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml más 100 μl de solución estándar interna (ácido malónico-d2 a 10 mg / ml en concentración de agua destilada) y luego 800 μl de metanol. Las muestras se mezclan con vortex durante 15 s y a seguir se sedimentan las proteínas en una cen-trífuga a 15.800 g durante 15 min. Una alícuota de 800 μl se separa y se liofiliza durante 18 h. Las muestras liofilizadas se reconstituyen en 200 μl de fase móvil para realizar el análisis en espectrómetro de masas de alta resolución Synapt G2 (Waters, Milford). Para el análisis se utilizará una columna UPLC - ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm x 100 mm, 1.7 μm (Waters) con filtro en línea de precolumna (Waters, Milford). La fase móvil A es agua con ácido fórmico al 0,1% (vol / vol) y la fase móvil B es metanol con ácido fórmico al 0,1% (vol / vol).
El análisis de los espectros de masa se realizará con MarkerLynx, un paquete incluido dentro del software MassLynx (Waters) dedicado al análisis y la interpretación estadística de los conjuntos de datos de metabolómica. 3
Metabolómica dirigida
Determinación de ácidos grasos:
1.	El paciente lleva la muestra de materia fecal, el mismo día de la toma, al Hospital.
2.	Durante el transcurso de las siguientes 24hs se coordina el envío, con hielo seco, al laboratorio de la Universidad Nacional de Quilmes
3.	Allí se refrigeran con ultrafreezer.
4.	Luego, cada muestra se separa en dos y se realiza la extracción de ADN y la preparación para el análisis de ácidos grasos de cadena corta. 
5.	Las muestras, ya filtradas, son enviadas con hielo seco al laboratorio INMET, que realizará el análisis de ácidos grasos de cadena corta.

El protocolo conservación y transporte heces es el mismo que el ya descripto en el apartado de análisis de microbiota.
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Detección y  Cuantificación de ácidos orgánicos por HPLC-UV
Equipamiento y condiciones de corrida
Para esta técnica se utiliza la columna Aminex HPX-87H, 300mm x 7.8mm (empacada con una matriz basada en co-polímeros, poli-[estireno-divinilbenceno sulfonatado] (ver figura debajo), al 8% de cross-linking, de forma iónica hidrógeno, tamaño de partícula de 9 μm y rango de pH 1-3). Dadas estas características, este tipo de columnas pueden se-parar compuestos tales como: ácidos carboxílicos, ácidos grasos volátiles, ácidos grasos de cadena corta, cetonas y otros sub-productos metabólicos neutros. Aunque más fre-cuentemente, se las utiliza para el análisis de ácidos orgánicos, productos de fermenta-ciones, por medio de la técnica cromatográfica de partición iónica moderada.
Acondicionamiento de la columna previo a las corridas:
Equilibrado: lavado de bomba A con fase móvil; colocación del flujo a 0.2 mL/min (con dicha bomba) y seteo de la temperatura del compartimiento de columna a 45°C; dejar equilibrando por 1 h;
Acondicionamiento de flujo: subir el flujo de a 0.05 ml/min por 30 min. hasta llegar al flujo de corrida final: 0.6 ml/min.
La corrida cromatográfica presenta las siguientes características:
Flujo: 0.6 mL/min;
Temperaturas: de 45°C en el compartimento de la columna y de 25°C en el autosampler;
Fase móvil: isocrática, 5 mM H2SO4 en H2O MQ (pH~2); 
Presión: de trabajo: entre 50-75 bar; máxima: 100 bar; usual: ~52 bar;
Detector: UV, @210 nm;
Método de corrida (actual): C:\Xcalibur\methods\Metodo_Acidos_Organicos;
Acondicionamiento de la columna posterior a las corridas:
Al finalizar las corridas, bajar manualmente el flujo a 0.2 mL/min, apagar el heater del compartimiento de la columna y seguir corriendo a dicho flujo hasta que la misma llegue a temperatura ambiente;
Finalmente, sacar la columna y lavar celda UV y conexiones con el solvente metanol.

-Preparación de muestras
Depende del origen de las mismas:
Fermentación escala 1L: la muestra se diluye 1/10 (100 μl en 1 mL final) en H2O MQ, se filtra a través de una membrana de 0.22 μm y se coloca en vial para inyectar (~20 μL);
Desde curvas normales de crecimiento (volúmenes de ~10 mL): la muestra (~1 mL) direc-tamente se filtra a través de una membrana de 0.22 μm y se coloca en vial para inyectar (~20 μL).
Corrida con estándares de ácidos orgánicos (5 μL)
Código comercial de mix de estándares: Cat. #125-0586, Organic Acid Standard (BioRad). 
